小鼠D 乳酸脱氢酶(D-LDH)ELISA试剂盒使用说明书
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EK-Bioscience
Biotechnology Co., Ltd. Shanghai enzyme research
This kit is for in vitro research use, not for clinical diagnosis!
（本试剂盒仅供体外研究使用，不用于临床诊断！）
小鼠D 乳酸脱氢酶(D-LDH)酶联免疫分析试剂盒
Mouse(D-LDH)ELISA Kit
CAS.NO:Ek-M20042
声明：尊敬的客户，感谢您选用本公司的产品。本试剂盒用于测定小鼠血清、血浆及相关液体样本中D 乳酸脱氢酶(D-LDH)含量。使用前请仔细阅读说明书并检查试剂组分！如有疑问，请及时联系我们。
实验原理
本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中小鼠D 乳酸脱氢酶(D-LDH)水平。用纯化的小鼠D 乳酸脱氢酶(D-LDH)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入D 乳酸脱氢酶(D-LDH)，再与HRP 标记的D 乳酸脱氢酶(D-LDH)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB 显色。TMB 在HRP 酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的D 乳酸脱氢酶(D-LDH)呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），通过标准曲线计算样品中小鼠D 乳酸脱氢酶(D-LDH)浓度。
试剂盒组成：
中文名称English name 96T/48T 含量保存
ELISA 酶标板(可拆卸） Microelisa stripplate 8×12 / 8×6 * 2-8℃
标准品(120ng/L) Standard 1 瓶0.5ml * 2-8℃
标准品稀释液Standard diluent 1 瓶1.5ml * 2-8℃
酶标试剂HRP-Conjugate reagent 1 瓶6 ml/3ml * 2-8℃
样品稀释液Sample diluent 1 瓶6 ml/3ml * 2-8℃
显色剂A 液Chromogen Solution A 1 瓶6 ml/3ml * 2-8℃
显色剂B 液Chromogen Solution B 1 瓶6 ml/3ml * 2-8℃
终止液Stop Solution 1 瓶6 ml/3ml * 2-8℃
浓缩洗涤液wash solution 1 瓶20ml * 2-8℃
说明书Instruction 1 份*
封板膜Closure plate membrane 2 片*
密封袋Sealed bags 1 个*
标本要求
1. 血清：室温血液自然凝固10-20 分钟后，离心20 分钟左右（2000-3000 转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA、柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂，混合10-20 分钟后，离心20 分钟左右（2000-3000 转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成应再次离心。
3. 尿液：用无菌管收集。离心20 分钟左右（2000-3000 转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照此实行。
4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20 分钟左右（2000-3000 转/分）。仔细收集上清。
5. 培养细胞:检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml 左右。通过反复冻融或加入组织蛋白萃取试剂，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20 分钟左右（2000-3000 转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
6. 组织标本:切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS（PH7.4），或组织蛋白萃取试剂, 用手工或匀浆器将标本匀浆化。离心20 分钟左右（2000-3000 转/分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。
7. 标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融
8.不能检测含NaN3 的样品，因NaN3 抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。
试验所需自备物品:
1. 酶标仪(450nm 波长滤光片)
2. 高精度移液器，EP 管及一次性吸头
3. 37℃恒温箱，双蒸水或去离子水
4. 吸水纸
操作步骤
1. 标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。
60ng/L 5 号标准品150μl 的原倍标准品加入150μl 标准品稀释液
30ng/L 4 号标准品150μl 的5 号标准品加入150μl 标准品稀释液
15ng/L 3 号标准品150μl 的4 号标准品加入150μl 标准品稀释液
7.5.ng/L 2 号标准品150μl 的3 号标准品加入150μl 标准品稀释液
3.75ng/L 1 号标准品150μl 的2 号标准品加入150μl 标准品稀释液
2. 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5 倍)。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
3. 温育：用封板膜封板后置37℃温育30 分钟。
4. 配液：将30 倍（48T 的20 倍）浓缩洗涤液用蒸馏水30 倍稀释后备用
5. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30 秒后弃去，如此重复5 次，拍干。
6. 加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。
7. 温育：用封板膜封板后置37℃温育30 分钟。
8. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30 秒后弃去，如此重复5 次，拍干。
9. 显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色
10 分钟.
10. 终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。
11. 测定：以空白空调零，450nm 波长依序测量各孔的吸光度（OD 值）。测定应在加终止液后15 分钟以内进行。
计算
以标准物的浓度为横坐标，OD 值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD 值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD 值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD 值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
注意事项
1．试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30 分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。
2．浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。
3．各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间最好控制在5 分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。
4． 请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本OD 值大于标准品孔第一孔的OD 值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n 倍）后再测定，计算时请最后乘以总稀释倍数（×n×5）。
5． 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
6．底物请避光保存。
7．严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准.
8．所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。
9．本试剂不同批号组分不得混用。
实验目的、灵敏度、检测范围和重复性:
●实验目的：测定小鼠血清、血浆及相关液体样本中D 乳酸脱氢酶(D-LDH)含量。
●灵敏度：最小可测0.9ng/L。
●检测范围1.5ng/L - 70ng/L。
●重复性：板内，板间变异系数均<10%。
问题分析
若实验效果不好，请及时对显色结果拍照，保留所用板条及未使用试剂，并妥善保存，然后联系我公司技术支持为您解决问题。同时您也可以参考以下资料：
问题描述可能原因相应对策
标准曲线梯
度差
吸液或加液不准检查移液器及吸头
标准品稀释不正确溶解标准品稍微旋转瓶身，轻轻混匀使粉末完全溶解
洗涤不完全保证洗涤时间和洗涤次数及每孔的加液量
显色很弱或
无色
孵育时间太短保证充足的孵育时间
实验温度不正确使用推荐的实验温度
试剂体积不够或漏加检查吸液及加液过程，保证所有试剂按顺序足量添加
稀释不正确
读数数值低酶标仪设置不正确在酶标仪上检查波长及滤光片设置
提前打开酶标仪预热
变异系数大加液不正确检查加液情况
背景值高
检测抗体的工作浓度使用推荐的稀释倍数
酶标板洗涤不完全重新阅读操作手册，保证清洗完全；如果用自动洗板
机，请检查所有的出口是否有堵塞
洗液有污染配制新鲜的洗液
灵敏度低ELISA 试剂盒保存按说明书要求保存相关试剂
读数前未终止OD 读数前应在每孔中加入终止液
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